Hiperkolesterolemik ve kronik hipertansif sıçanlarda kan-beyin bariyer geçirgenliğindeki değişiklikler ve anjiyotensin ii'nin etkileri
Kalaycı, Rivaze
Hiperkolesterolemik ve kronik hipertansif sıçanlarda kan-beyin bariyer geçirgenliğindeki değişiklikler ve anjiyotensin ii'nin etkileri Rivaze Kalaycı; Danışman: Mehmet Kaya - İstanbul İstanbul Üniversitesi 2005 - 81 s. şek. 27 cm
GİRİS VE AMAÇ 1 GENEL BİLGİLER 3 KBB 3 KBB Tarihçesi 3 KBB Fonksiyonları 4 KBB Morfolojisi 5 KBB Endotel Hücreleri 6 KBB Astrosit Hücreleri 8 KBB Perisit Hücreleri 9 KBB Sıkı Bağlantı Proteinleri 9 Transmembran Proteinler 10 Sitoplazmik Proteinler 12 Hücre iskelet Protenleri 14 Damar Endotol Hücresi 14 Endotel Hücre Disfonksiyonu 15 NO ve Hipertansiyon 15 NO 15 Hipertansiyon 17 Kolesterol 19 Ateroskleroz 20 ANG II 21 Oksidan ve Antiosidan Aktivite 23 Sitokinler 24 VEGF 25 GEREÇ VE YÖNTEM 26 Deney Hayvanları 26 Deney Modelleri 27 Hiperkolesterolemi Modeli 27 Kronik Hipertansiyon Modeli 27 Akut Hipertansiyon Modeli 27 Hiperkolesterolemik Kronik Hipertansif Model 27 Deney Protokolü 27 Anestezi 28 Kan Basıncı Ölçümü 28 İndirekt Kan Basıncı Ölçümü 28 Direkt Kan Basıncı Ölçümü 29 EB Boyasınım Kantitatif Tayini 29 Perfüze-Fiksasyon Yöntemi 30 Dokuların Takibi 30 Biyokimyasal Parametreler 31 Plazmada Total Kolesterol 31 Plazmada NO 31 Plazmada TNF-α 32 Plazmada MDA 33 Plazmada Ox-LDL 34 Eritrositte GSH 35 Hemoglobin Analizi 35 Plazmada SOD 35 Plazmada Katalaz 36 Masson Trikron Boyası 36 İmmunohistokimyasal Boyamalar 37 İstatistiksel Değerlendirme 38 BULGULAR 39 Vücut Ağırlığındaki Değişiklikler 39 Kan Basıncındakı Değişklikler 40 Biyokimyasal Parametrelerlerdeki Değişiklikler 42 Total Kolesterol Düzeyindeki Değişiklikler 42 NO,TNF-α VE Oksidan Aktivitedeki Değişiklikler 43 NO Düzeyindeki Değişiklikler 43 TNF -α Düzeyindeki Değişiklikler 44 Oksidan Aktivitedeki Değişiklikler 45 MDA Düzeyindeki Değişiklikler 45 Ox -LDL Düzeyindeki Değişiklikler 45 Antioksidan Aktivitedeki Değişiklikler 46 GSH Düzeyindeki Değişiklikler 47 SOD Düzeyindeki Değişiklikler 47 Katalaz Düzeyindeki Değişiklikler 48 Histopatolojik Değişiklikler 48 Beyin Dokusunda EB Boyasının Kantıtatif Değişiklikleri 49 İmmunohistokimya Boyanmalarındakı Değişiklikler 50 Okludin Boyasındakı Değişiklikler 51 ZO-1 Boyanmasındaki Değişiklikler 51 GFAP Boyanmasındaki Değişiklikler 54 VEGF Boyanmasındaki Değişiklikler 54 TARTİŞMA 57 ÖZET 67 ABSTRACT 69 KAYNAKLAR 71 ÖZGEÇMİŞ 80
'Bu çalışmada, hiperkolesterolemik hiperstansif koşullar ve/ veya ANG II uygulamasının KBB üzerine etkileri aratırıldı. Bu amaçla, Wistar albino erişkin erkek sıçanlar kullanıldı. Hiperkolesterolemi, hayvanların 8 hafta % 2 kolesteron, % 0,5 kolik asit % 0,25 tiorasil'ın eklendiği pelet yemle beslenmeleri sonucunda oluşturuldu. Bu uygulamanın 5. haftasında itibaren hiperkolesterolemiye ek plarak kronik hiğertansiyon oluşturan için, hayvanların içme suyuna L - NAME ( 1mg/ ml) 3 hafta süresince eklendi. Akut hipertansif ataklar ANG II'nin 60 mg/ ml dozunda femoral vene bolus enjeksıyonuyla gerçekleştirilini .Kronık koleston ve L - NAME uygulamaları öncesi ve sonrası ile ANG II verilmesini takiben kan basıncı ölçümleri yapıldı. KBB'deki geçirgenlik değişikliklerini gösteren için beynin sağ serebal korteks, sol serebral korteks,diensefalon ve serebellum bölgelerinde EB boyasının kantitatif ölçümleri yapıladı. Sıçanların plazma total kolesteron, NO, TNF - a, MDA, Ox - LDL, SOD, VEGF ile eritrosit GSH miktarları tayin edildi. Hayvanların berin kesitlerinde, GRAF, VEGF, ile sıkı bağlantı proteınlerinde oklundin ve ZO - 1 için immunohıstokımsyasal boyamalar yapıldı. Bütün gruplardaki hayvanların beyın kesitlerıne, kolesteron uygulanan hayvanların ayrıca karotis ve aortalarına Masson trikom boyası uygulandı. Hiperkolesterolemik hipertansif hayvanlarda akun kan basıncı artışına karşı KBB geçirgendiğinde izlenen artışın, kronik hiperstansif hayvanlardakinden daha az olduğu görüldü. Kolesterol tek başına arttırdı. L - NAME uygulanması oksıdan aktivite artışına, plazma NO miktarı ve antioksidan aktivite azalmasına ayrıca, okludin, ZO - 1 ile GRAF boyanmalarında zayıflamaya yol açtı. Kolesteron uygulanması NO konsantrasyonu ile oksidan aktivitede artışa ve antioksidan aktivitede azalmaya neden oldu. Bu uygulama GRAF ve VEGF boyanma şiddetlerinde artışe, okludi ve ZO - 1'de ise azalma görülmezken, okludin, ZO - 1 ve GRAP boyanmalarında artış gerçekleşti. Hiperkolesterolemik hiperstansif hayvalnlara ANG II verilerek oluşturulan akut kan basıncı artışına yanıt olarak, sıkı bağlantı proteinlerinden okludin ve ZO - 1, astrositlerdeki GRAP, nöron ve endotel hücrelerindeki VEGF boyanmasında artış bulundu. Sonuç olarak, bu çalışma hiperkolesteronlemik hipertamsiyondakinnden daha az KBB geçigenlik artışına sebep olduğunu ve bu VEGF boyanmasındakı artışın işaret ettiği endotel hücresinin kısmen korunması ve/veya NO'nun artışına bağlı olabileceğini göstermektedir. Bu çalışmada gösterilen KBB gecirgenlik değişikliklerinin ortaya çıkmasında, hiperkolesterolemi ve / veya kronik basıncı, okludin, ZO - 1, GRAP ve VEGF düzeylerindeki değişiklikleri içeren birçok mekanizma rol oynayabilir. Anahtar Kelimeler: Kan - Bayin Bariyeri, Hiperkolesterolemi, Hipertaniyon, Nitrik Oksit, Okludin, ZO - 1, GRAP, VEGF. ABSTRACT THE ALTERATIONS OF THE BLOOD-BRAIN BARRIER PERMEABILITY IN HYPERCHOLESTEROLEMIC AND CHRONIC HYPERTENSIVE RATS AND THE INFLUENCE OF ANGIOTENSIN II In this study, the effects of hypercholesterolemic plus hypertensive conditions and/or acute ANG II administration on the BBB were investigated. For this purpose, adult male wistar albino rats were used. Hypercholesterolemia was induced by feeding the animals with pellets supplemented with 2% cholesterol, 0.5% cholic acid and 0.25% thiouracil for 8 weeks. Starting from the 5 th week of hypercholesterolemic diet, L-NAME (1mg/ml) was added into the drinking water of animals for 3 weeks to induce chronic hypertension along with hypercholesterolemia. Acute hypertensive episodes were evoked by bolus injection of ANG II (60 ug/kg) into the femoral vein. Blood pressure measurements were performed following ANG II administration as well as before and after chronic cholesterol and L-NAME treatments. In order to demonstrate the permeability changes in BBB, quantitative EB dye measurements were made at the left cerebral cortex, right cerebral cortex, and diencephalon and cerebellum regions of brain. Total cholesterol, NO, TNF-a, MDA,Ox-LDL,SOD and catalase concentrations in plasma and GSH level in erythrocytes of rats were determined. Immunohistochemical staining was performed for GFAP, VEGF and tight junction proteins occludin and ZO-1 in brain sections of rats. Masson trichrom staining was performed for sections of all animals and also carotid artery and aorta sections of cholesterol-treated animals. The increase in BBB permeability by acute blood pressure elevation in hypercholesterolemic plus hypertensive animals was seen to be less than in chronic hypertensive animals. The blood pressure was increased with L-NAME administration but not with cholesterol alone. L-NAME treatment caused an increase in oxidant activity, a decrease in plasma NO concentration and antioxidant activity and attenuation in occludin, ZO-1 and GFAP immunostaining. A treatment with cholesterol led to an increase in NO concentration and oxidant activity and a decrease in antioxidant activity. Besides, this treatment caused an enhancement in GFAP and VEGF and attenuation in occludin and ZO-1 staining intensities. While cholesterol plus L-NAME treatment did not cause a decrease in antioxidant catalase activity, an increase in staining intensity for occludin ZO-1 and GFAP was observed. In response to acute blood pressure elevation induced by ANG II administration, an increase in the intensity of staining for occludin and ZO-1 in tight junctions, GFAP in astrocytes and VEGF in neuron and endothelium was observed in hypercholesterolemic plus hypertensive animals. In conclusion, the study shows that acute blood pressure elevation in hypercholesterolemic plus hypertensive rats causes less prominent BBB permeability increases than that obtained in chronic hypertension which may be due to a partial sparing of endothelial cells as reflected by an increase in VEGF staining intensity and/or an increase in NO level in the former state. A variety of mechanisms may play role in the occurrence of BBB permeability changes observed in this study, including the changes in oxidant and antioxidant activities, blood pressure and expression of tight junction proteins and GFAP, which are related to hypercholesterolemia and/or chronic hypertension. Key Words: Blood-Brain Barrier, Hypercholesterolemia, Hypertension, Nitric Oxide, Occludin, ZO-1, GFAP, VEGF. '
Fizyoloji Anabilim Dalı
Department of Physiology
Hiperkolesterolemik ve kronik hipertansif sıçanlarda kan-beyin bariyer geçirgenliğindeki değişiklikler ve anjiyotensin ii'nin etkileri Rivaze Kalaycı; Danışman: Mehmet Kaya - İstanbul İstanbul Üniversitesi 2005 - 81 s. şek. 27 cm
GİRİS VE AMAÇ 1 GENEL BİLGİLER 3 KBB 3 KBB Tarihçesi 3 KBB Fonksiyonları 4 KBB Morfolojisi 5 KBB Endotel Hücreleri 6 KBB Astrosit Hücreleri 8 KBB Perisit Hücreleri 9 KBB Sıkı Bağlantı Proteinleri 9 Transmembran Proteinler 10 Sitoplazmik Proteinler 12 Hücre iskelet Protenleri 14 Damar Endotol Hücresi 14 Endotel Hücre Disfonksiyonu 15 NO ve Hipertansiyon 15 NO 15 Hipertansiyon 17 Kolesterol 19 Ateroskleroz 20 ANG II 21 Oksidan ve Antiosidan Aktivite 23 Sitokinler 24 VEGF 25 GEREÇ VE YÖNTEM 26 Deney Hayvanları 26 Deney Modelleri 27 Hiperkolesterolemi Modeli 27 Kronik Hipertansiyon Modeli 27 Akut Hipertansiyon Modeli 27 Hiperkolesterolemik Kronik Hipertansif Model 27 Deney Protokolü 27 Anestezi 28 Kan Basıncı Ölçümü 28 İndirekt Kan Basıncı Ölçümü 28 Direkt Kan Basıncı Ölçümü 29 EB Boyasınım Kantitatif Tayini 29 Perfüze-Fiksasyon Yöntemi 30 Dokuların Takibi 30 Biyokimyasal Parametreler 31 Plazmada Total Kolesterol 31 Plazmada NO 31 Plazmada TNF-α 32 Plazmada MDA 33 Plazmada Ox-LDL 34 Eritrositte GSH 35 Hemoglobin Analizi 35 Plazmada SOD 35 Plazmada Katalaz 36 Masson Trikron Boyası 36 İmmunohistokimyasal Boyamalar 37 İstatistiksel Değerlendirme 38 BULGULAR 39 Vücut Ağırlığındaki Değişiklikler 39 Kan Basıncındakı Değişklikler 40 Biyokimyasal Parametrelerlerdeki Değişiklikler 42 Total Kolesterol Düzeyindeki Değişiklikler 42 NO,TNF-α VE Oksidan Aktivitedeki Değişiklikler 43 NO Düzeyindeki Değişiklikler 43 TNF -α Düzeyindeki Değişiklikler 44 Oksidan Aktivitedeki Değişiklikler 45 MDA Düzeyindeki Değişiklikler 45 Ox -LDL Düzeyindeki Değişiklikler 45 Antioksidan Aktivitedeki Değişiklikler 46 GSH Düzeyindeki Değişiklikler 47 SOD Düzeyindeki Değişiklikler 47 Katalaz Düzeyindeki Değişiklikler 48 Histopatolojik Değişiklikler 48 Beyin Dokusunda EB Boyasının Kantıtatif Değişiklikleri 49 İmmunohistokimya Boyanmalarındakı Değişiklikler 50 Okludin Boyasındakı Değişiklikler 51 ZO-1 Boyanmasındaki Değişiklikler 51 GFAP Boyanmasındaki Değişiklikler 54 VEGF Boyanmasındaki Değişiklikler 54 TARTİŞMA 57 ÖZET 67 ABSTRACT 69 KAYNAKLAR 71 ÖZGEÇMİŞ 80
'Bu çalışmada, hiperkolesterolemik hiperstansif koşullar ve/ veya ANG II uygulamasının KBB üzerine etkileri aratırıldı. Bu amaçla, Wistar albino erişkin erkek sıçanlar kullanıldı. Hiperkolesterolemi, hayvanların 8 hafta % 2 kolesteron, % 0,5 kolik asit % 0,25 tiorasil'ın eklendiği pelet yemle beslenmeleri sonucunda oluşturuldu. Bu uygulamanın 5. haftasında itibaren hiperkolesterolemiye ek plarak kronik hiğertansiyon oluşturan için, hayvanların içme suyuna L - NAME ( 1mg/ ml) 3 hafta süresince eklendi. Akut hipertansif ataklar ANG II'nin 60 mg/ ml dozunda femoral vene bolus enjeksıyonuyla gerçekleştirilini .Kronık koleston ve L - NAME uygulamaları öncesi ve sonrası ile ANG II verilmesini takiben kan basıncı ölçümleri yapıldı. KBB'deki geçirgenlik değişikliklerini gösteren için beynin sağ serebal korteks, sol serebral korteks,diensefalon ve serebellum bölgelerinde EB boyasının kantitatif ölçümleri yapıladı. Sıçanların plazma total kolesteron, NO, TNF - a, MDA, Ox - LDL, SOD, VEGF ile eritrosit GSH miktarları tayin edildi. Hayvanların berin kesitlerinde, GRAF, VEGF, ile sıkı bağlantı proteınlerinde oklundin ve ZO - 1 için immunohıstokımsyasal boyamalar yapıldı. Bütün gruplardaki hayvanların beyın kesitlerıne, kolesteron uygulanan hayvanların ayrıca karotis ve aortalarına Masson trikom boyası uygulandı. Hiperkolesterolemik hipertansif hayvanlarda akun kan basıncı artışına karşı KBB geçirgendiğinde izlenen artışın, kronik hiperstansif hayvanlardakinden daha az olduğu görüldü. Kolesterol tek başına arttırdı. L - NAME uygulanması oksıdan aktivite artışına, plazma NO miktarı ve antioksidan aktivite azalmasına ayrıca, okludin, ZO - 1 ile GRAF boyanmalarında zayıflamaya yol açtı. Kolesteron uygulanması NO konsantrasyonu ile oksidan aktivitede artışa ve antioksidan aktivitede azalmaya neden oldu. Bu uygulama GRAF ve VEGF boyanma şiddetlerinde artışe, okludi ve ZO - 1'de ise azalma görülmezken, okludin, ZO - 1 ve GRAP boyanmalarında artış gerçekleşti. Hiperkolesterolemik hiperstansif hayvalnlara ANG II verilerek oluşturulan akut kan basıncı artışına yanıt olarak, sıkı bağlantı proteinlerinden okludin ve ZO - 1, astrositlerdeki GRAP, nöron ve endotel hücrelerindeki VEGF boyanmasında artış bulundu. Sonuç olarak, bu çalışma hiperkolesteronlemik hipertamsiyondakinnden daha az KBB geçigenlik artışına sebep olduğunu ve bu VEGF boyanmasındakı artışın işaret ettiği endotel hücresinin kısmen korunması ve/veya NO'nun artışına bağlı olabileceğini göstermektedir. Bu çalışmada gösterilen KBB gecirgenlik değişikliklerinin ortaya çıkmasında, hiperkolesterolemi ve / veya kronik basıncı, okludin, ZO - 1, GRAP ve VEGF düzeylerindeki değişiklikleri içeren birçok mekanizma rol oynayabilir. Anahtar Kelimeler: Kan - Bayin Bariyeri, Hiperkolesterolemi, Hipertaniyon, Nitrik Oksit, Okludin, ZO - 1, GRAP, VEGF. ABSTRACT THE ALTERATIONS OF THE BLOOD-BRAIN BARRIER PERMEABILITY IN HYPERCHOLESTEROLEMIC AND CHRONIC HYPERTENSIVE RATS AND THE INFLUENCE OF ANGIOTENSIN II In this study, the effects of hypercholesterolemic plus hypertensive conditions and/or acute ANG II administration on the BBB were investigated. For this purpose, adult male wistar albino rats were used. Hypercholesterolemia was induced by feeding the animals with pellets supplemented with 2% cholesterol, 0.5% cholic acid and 0.25% thiouracil for 8 weeks. Starting from the 5 th week of hypercholesterolemic diet, L-NAME (1mg/ml) was added into the drinking water of animals for 3 weeks to induce chronic hypertension along with hypercholesterolemia. Acute hypertensive episodes were evoked by bolus injection of ANG II (60 ug/kg) into the femoral vein. Blood pressure measurements were performed following ANG II administration as well as before and after chronic cholesterol and L-NAME treatments. In order to demonstrate the permeability changes in BBB, quantitative EB dye measurements were made at the left cerebral cortex, right cerebral cortex, and diencephalon and cerebellum regions of brain. Total cholesterol, NO, TNF-a, MDA,Ox-LDL,SOD and catalase concentrations in plasma and GSH level in erythrocytes of rats were determined. Immunohistochemical staining was performed for GFAP, VEGF and tight junction proteins occludin and ZO-1 in brain sections of rats. Masson trichrom staining was performed for sections of all animals and also carotid artery and aorta sections of cholesterol-treated animals. The increase in BBB permeability by acute blood pressure elevation in hypercholesterolemic plus hypertensive animals was seen to be less than in chronic hypertensive animals. The blood pressure was increased with L-NAME administration but not with cholesterol alone. L-NAME treatment caused an increase in oxidant activity, a decrease in plasma NO concentration and antioxidant activity and attenuation in occludin, ZO-1 and GFAP immunostaining. A treatment with cholesterol led to an increase in NO concentration and oxidant activity and a decrease in antioxidant activity. Besides, this treatment caused an enhancement in GFAP and VEGF and attenuation in occludin and ZO-1 staining intensities. While cholesterol plus L-NAME treatment did not cause a decrease in antioxidant catalase activity, an increase in staining intensity for occludin ZO-1 and GFAP was observed. In response to acute blood pressure elevation induced by ANG II administration, an increase in the intensity of staining for occludin and ZO-1 in tight junctions, GFAP in astrocytes and VEGF in neuron and endothelium was observed in hypercholesterolemic plus hypertensive animals. In conclusion, the study shows that acute blood pressure elevation in hypercholesterolemic plus hypertensive rats causes less prominent BBB permeability increases than that obtained in chronic hypertension which may be due to a partial sparing of endothelial cells as reflected by an increase in VEGF staining intensity and/or an increase in NO level in the former state. A variety of mechanisms may play role in the occurrence of BBB permeability changes observed in this study, including the changes in oxidant and antioxidant activities, blood pressure and expression of tight junction proteins and GFAP, which are related to hypercholesterolemia and/or chronic hypertension. Key Words: Blood-Brain Barrier, Hypercholesterolemia, Hypertension, Nitric Oxide, Occludin, ZO-1, GFAP, VEGF. '
Fizyoloji Anabilim Dalı
Department of Physiology